Utilizzo di più larve nel kit“AFB TEST“ un sistema per diagnosticare la peste americana

Continuando lo studio sull’affidabilità e praticità del kit AFB Test della Vita Europe Ltd., nel corso dell’anno 2004, l’Istituto di Entomologia agraria di Milano e l’Istituto Nazionale di Apicoltura hanno collaborato in una nuova fase della sperimentazione, allo scopo di approfondire alcuni aspetti applicativi, in particolare la possibilità di utilizzo di più larve nello stesso test.
Dalle prove effettuate nell’anno precedente si è visto che a livelli bassi di concentrazione di spore ( d i 20.000.000 per ml di soluzione estraente contenuta nella fiala utilizzata per omogeneizzare la larva), l’intensità del tratto della linea T (che indica il risultato del test) è debolissima o assente. Sotto questo limite, analizzando una sola larva contenente spore di Paenibacillus larvae subsp. larvae, si rischia di non rilevare l’infezione.
Aumentando però il numero di larve probabilmente infette, e testandole contemporaneamente con lo stesso kit ELISA, si aumenta il numero di spore nella soluzione e quindi la leggibilità della linea T. A livello pratico quindi, il tecnico o l’apicoltore, avendo di fronte larve “dubbie” per l’assenza di sintomi ben precisi di peste americana (livello subclinico), potrebbe esaminare con lo stesso test più larve provenienti dallo stesso alveare.

METODOLOGIA SPERIMENTALE E RISULTATI
La prova è stata svolta seguendo il seguente schema. *Istituto di Entomologia agraria di Milano **Istituto Nazionale di Apicoltura
GRUPPO I
Sono state esaminate larve sane prelevate prima dell’opercolatura, dopo aver verificato l’assenza di spore mediante osservazione al microscopio. Il test è stato eseguito dapprima su una larva, poi su omogeneati preparati ciascuno con più larve, da due fino a otto. In questo caso, in assenza totale d’infezione, si è solo monitorata l’intensità del tratto C (controllo) che compare nella finestra del supporto del kit.
Ogni omogeneato di una o più larve è stato provato contemporaneamente su cinque supporti (cinque repliche per otto casi).
GRUPPO II
Sono state esaminate propupe con sintomi evidenti e di consistenza liquida-filante, di colore marrone scuro o chiaro. Anche in questo caso sono state preparate più soluzioni costituite da un numero crescente di larve. Ogni soluzione è stata provata su cinque supporti ed è stata monitorata sia l’intensità del tratto C (controllo), sia l'intensità del tratto T (test)



RISULTATI E DISCUSSIONE
Come si può facilmente vedere dalle tabelle, si nota che per il gruppo I, introducendo fino a sei larve nella soluzione da saggiare, la linea di controllo C rimane relativamente stabile; oltre alle sei larve, la linea inizia ad essere poco leggibile. Invece, utilizzando larve infette (gruppo II), la linea C rimane visibile in modo marcato utilizzando al massimo tre larve contemporaneamente, mentre può risultare invisibile oltre le cinque larve, il che vanifica il test.
Nello stesso gruppo, la linea T rimane ben marcata fino a 5 larve, mentre diminuisce la sua intensità con un numero maggiore di larve rimanendo comunque visibile.
Queste osservazioni ci permettono di concludere che per incrementare la capacità di rilevazione del test, si può applicare il medesimo ad un pool di più larve. Si consiglia tuttavia di non superare le 3 o 4 larve per volta, pena la compromissione dell’attendibilità del test.
Infatti, con un quantitativo superiore di larve, la linea C, indicatrice della buona funzionalità del test, potrebbe non formarsi, mentre la linea T, indicatrice della reazione specifica, potrebbe ridurre sensibilmente la propria intensità con il rischio di non venire rilevata anche in presenza di larve infette (falsi negativi).
Si ritiene dunque il kit AFB Test della Vita Europe Ltd un valido strumento per la conferma diagnostica della peste americana in campo o anche in laboratorio; come ogni strumento però, deve essere usato con la dovuta attenzione basata sulla conoscenza delle sue caratteristiche e principi di funzionamento .

Confronto fra i risultati di intensità dei tratti tra supporti per diagnosticare la peste americana.	Boccettine della soluzione estraente dove vengono inserite le larve.

Marco Giorgetti Istituto di Entomologia agraria di Milano
Emanuele Carpana Istituto Nazionale di Apicoltura